专访北大药学院糖科学家叶新山教授:“甜蜜”疫苗,白色瘟疫的降魔曙光

如果说生命是一幕波澜壮阔的大戏,核酸无疑构成了最初的原著和繁复的脚本。然后,数量惊人的蛋白质粉墨登场,成为演绎生命传奇的明星和配角;然而这些特殊的生旦净末丑,之所以能呈现千姿百态的“人设”,有一多半得益于千变万化的“糖衣道具”。

古往今来,人们都喜欢用源于蔗糖的味道“甜”,来表达味蕾与内心的喜悦和幸福。然而近三十年来随着人们对生命认识的不断深入,科学家们发现糖不只是能量和甜蜜的代名词。糖类物质不仅直接参与几乎所有重要的生命活动,更以缀合物的方式结合体内超过50%的蛋白质,而糖链或糖残基正是许多糖蛋白得以更好发挥生物功能的关键所在。

抗体蛋白表面包裹着瑰丽的糖衣(图片来源:Getty Images)

然而与核酸和多肽的线性序列相比,柔性强、支链多的糖类化合物结构更为复杂,其合成和分离纯化困难重重,而高通量测序手段至今仍然缺位,这给糖科学研究者们带来了巨大的挑战。北大药学院叶新山教授团队今年3月在多糖合成领域取得突破性进展,利用其课题组发展的原创糖基供体预活化液相合成策略,全合成92个单糖单元组成的阿拉伯半乳聚糖分子;这是迄今人类合成的最大最复杂的均一多糖分子,而且对于抗结核杆菌疫苗和药物新靶标的发现具有重要意义。叶新山教授为长江学者奖励计划特聘教授,于1996-2000年在美国Scripps研究所接受博士后训练,其成果曾先后五次被美国《科学》等杂志予以专栏评论,于2010年获得药明康德生命化学研究奖,2015年获得张树政糖科学杰出成就奖。

糖疫苗:结核病及癌症全新防治策略

药明康德:结核病自古以来被誉为白色瘟疫,全球1/3人口皆为结核杆菌带菌者。您发表在《Nature Communications》杂志上的阿拉伯半乳聚糖全合成成果,对于研制全新结核病疫苗和药物有哪些重要意义?这种多糖分子本身有哪些生物活性?

叶新山教授:阿拉伯半乳聚糖是一类结构复杂的多糖,在多种乔木体内含量很高,也广泛存在于多种蔬菜、中草药当中。国外学者对于这类多糖的功能研究不少,认为它们具备多种免疫活性,包括提高机体内淋巴细胞杀伤能力、高浓度定向肝脏运输能力、促进肠道益生菌生长、降低血糖及胆固醇水平等等。但阿拉伯半乳聚糖也是结核杆菌细胞壁的重要组分,它不仅是抗结核药物如乙胺丁醇的作用靶标,也是结核杆菌重要的抗原性成分之一。该多糖分子结构极其复杂,在化学合成上极具挑战性。

▲结核杆菌(图片来源:WHO官网)

结核杆菌致病以慢性呼吸道发病为主,但其所导致的结核病可以入侵人体各个器官,在几千年人类发展史中肆虐于世界各地。二战后虽然不少国家的结核病发病率一度下降,但随着环境污染加剧、人口流动增加、糖尿病发病率飙升以及艾滋病毒导致的耐多药肺结核的出现,该传染病再度成为全球关注的健康问题,与艾滋病、疟疾一同被列为世界三大传染病。据WHO报道,全球1/3人口感染了结核杆菌,2015年报告超过1000万新结核病病例,年死亡人数接近200万。目前,全球多国的新生儿会在1周岁之内接种卡介苗,在一定程度上遏制了结核病蔓延的脚步。但卡介苗的保护程度并不让人满意,而且成年人并没有合适的结核病疫苗。愈来愈严重的结核杆菌耐药性问题,呼唤着医药工作者推出更加有效的预防性甚至治疗性疫苗。

结核杆菌之所以难以被普通的抗生素灭活,是因为它的细胞壁独特而复杂,对菌体构成了强大的保护屏障并赋予其多种天然耐药性,其荚膜还可以屏蔽普通消毒剂的伤害。其细胞壁中的糖类化合物在维持细胞壁结构和致病过程中发挥着重要作用,可以产生耐药酶使抗生素失活,并将常用抗生素药物排出细胞外。阿拉伯半乳聚糖、肽聚糖、脂阿拉伯甘露聚糖等物质构成了结核杆菌细胞壁的固有层,该菌体细胞壁外膜层、外膜外荚膜层也存在着多种多糖和糖脂复合物。过去曾有研究人员模拟了阿拉伯半乳聚糖的片段结构,发现可以轻度抑制菌体内呋喃半乳糖基转移酶和该细菌的多重耐药性基因;更重要的是,有临床结论证实:从结核病人体内可以分离出多种能识别阿拉伯半乳聚糖的抗体,提示该多糖具有开发成疫苗的潜力。由于从天然来源获得均一结构的多糖分子极其困难,所以我们希望以阿拉伯半乳聚糖的全合成作为突破口来研究新型糖类疫苗,激发人体内更多淋巴细胞的免疫功能,扼制结核病卷土重来的趋势。

▲阿拉伯半乳聚糖分子结构示意图(来源:Nature Communications)

药明康德:除了多糖分子,糖蛋白显然也是全新糖疫苗开发的重要靶点。您目前在糖疫苗研究方面,还有哪些与临床转化相关的疾病方向?

叶新山教授:糖类疫苗可以应用的疾病很广,我们目前正在研究一种治疗性癌症疫苗,属于主动的癌症免疫治疗肿瘤细胞恶性增殖与细胞表面糖复合物关系密切,细胞恶变过程中细胞膜表面的糖链结构会有明显变化,这种与正常细胞糖链有所不同的特殊糖链称为肿瘤相关糖抗原,可作为癌症诊断的标志物。比如,岩藻糖基化修饰的甲胎蛋白常常被用来检测受试者是否患有早期肝癌。甲胎蛋白也属于糖蛋白,主要来自胚胎的肝细胞;胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失,正常成年人血清中甲胎蛋白的含量微乎其微。但肝细胞癌变时,其血清内含量可能会增加,所以通过甲胎蛋白的岩藻糖基化来检测原位肝癌,其准确率可达到70%。

糖抗原不仅可以用于癌症的早期诊断,而且可以以它为基础研制疫苗。抗肿瘤糖疫苗的这种设想在上世纪90年代有人提出过,但至今并没有真正的产品上市。因为肿瘤细胞表面的糖抗原免疫原性较弱,只能与B细胞作用并引起短暂无免疫记忆的IgM抗体,所以我们希望对天然糖抗原进行适当修饰,然后将其与载体蛋白相连接制成疫苗,再注射到人体内使免疫系统产生抗体。该疫苗开发的关键之处在于:这种通过疫苗刺激而产生的抗体,必须要能够识别癌细胞表面所表达的天然糖抗原,而且这种通过接种产生的抗体滴度要超过人体针对天然糖抗原缀合物而产生的抗体滴度。目前我们已经找到几种具备疫苗开发潜力的糖蛋白缀合物,其中有一种疫苗在动物试验中能显著延长荷瘤小鼠生存期,小鼠体内经过疫苗接种而产生的抗体滴度也比较理想。我们已经申请并获得了欧洲、日本、美国和中国的专利,希望在十三五期间能够将新疫苗向临床推进。我们首先希望将疫苗用于乳腺癌或结肠癌患者的治疗,若效果好再扩大到其它肿瘤的治疗。

▲叶新山教授团队

千万糖蛋白富矿:揭开“糖衣”的神秘面纱

药明康德:人体内超过一半的蛋白都有糖基化修饰现象,请您介绍一下糖类化合物在生命体内发挥的重要作用,以及目前糖科学研究所面临的挑战。

叶新山教授:糖脂化合物以及糖蛋白都是细胞膜的重要组成部分。糖类及其缀合物能够编码的生物信息量浩如烟海,这主要是由其自身结构因素所决定的:糖单元之间含有多个羟基连接位点,糖苷键存在立体异构形式,糖链上存在很多分枝结构,而糖链的构象又千差万别,所有这些都使得糖的结构异常复杂。正因为如此,“糖衣”成为糖蛋白重要而丰富的功能信息载体,对细胞的生长发育、分化、代谢、识别反应和免疫反应等发挥了重要的调节作用。在超过1千万种糖蛋白的结构中,糖链可以介导细胞间通讯、病原体对宿主细胞入侵等多种过程。可以说,糖类化合物与所有的生命过程都密切相关,包括生、老、病、死

正因为糖类化合物的结构和功能复杂,生命体内的糖类化合物又呈现非均一的微观结构,所以糖链的结构分析面临着巨大挑战;相对于核酸与蛋白质这两类生物大分子的研究而言,进展比较缓慢。另一个挑战就是糖类化合物的合成。聚糖的合成难度也远远超过核酸与蛋白质:核酸中的磷酸二酯键的形成与蛋白质中肽键的形成都很高效,而聚糖中的糖苷键的形成却效率不高。另外,核酸可以通过PCR技术扩增,蛋白质也可以通过成熟的生物技术表达;而作为翻译后修饰的糖类化合物生物合成则缺乏固定模板,糖链合成所需的各种糖苷酶和糖基转移酶往往处在动态变化之中。

▲从受精卵形成开始,糖蛋白作用贯穿生老病死

药明康德:面对分析与合成手段的种种限制,您的团队在多年学术研究过程中依然实现了不少突破。请您介绍一下目前糖类合成的格局,以及您最新的合成策略。

叶新山教授:我的团队历年来主攻高效寡糖合成策略,而相应策略可以逐步应用于多糖合成。寡糖又叫低聚糖,指由2-10个单糖组成的化合物,而超过10个单糖分子的聚合物则可称为多糖。化学合成是寡糖类化合物合成的主要途径。关于寡糖化学合成目前大体上主要有三种策略:

第一类是固相合成,即模仿多肽的自动合成,将树脂作为固相载体连到糖基受体上,使糖基化反应在固相载体上进行。但是该方法通常需要使用大大过量的糖基供体,而且最后需要使用额外的步骤去除固相树脂。

第二类是我在Scripps参与研究的计算机辅助的一釜寡糖合成策略,该方法可以将多种糖模块按照活性高低的顺序加入反应容器,待前一步反应结束后再加入新的模块,而省去了中间体分离纯化的步骤。但是目标糖链的结构顺序未必与糖模块活性高低的顺序相吻合,而且相邻糖模块之间的反应活性必须有足够大的差别;所以必须依靠计算机软件辅助来挑选糖模块,需要通过不同保护基的引入来调整糖模块的反应活性,这样就会受到糖上保护基种类和数量的限制。

▲图片来源:叶新山课题组

第三类是我们所发展的另外一种液相合成法——基于糖基供体预活化的一釜寡糖合成策略。在这种反应策略中,糖基受体加入反应体系之前,糖基供体已经被预先活化为中间体,然后糖模块不管其反应活性高低都可在相同条件下发生偶联反应。这种一釜寡糖合成策略不需要复杂的保护基设计和操作,只需实验人员不断优化活化剂,以保证预活化完成时活化剂消耗完毕,以及预活化过程中产生的中间体不会影响后续反应。阿拉伯半乳聚糖由一条线性的半乳聚糖链(A链)和两条紧密靠近的高度分枝化的阿拉伯聚糖链(B链)所组成,此次全合成我们用的就是这个策略,并且在关键步骤中采用了我们自己所发展的活化剂。

过去对于聚糖的合成的最高水平通常为20-30糖,而在阿拉伯半乳聚糖的合成项目中,我们92糖的合成,一位博士生带着两个做本科生科研训练的同学仅用两年半的时间就完成了。如此高效的合成提示我们:今后对于复杂结构的多糖分子,其人工合成不再是可望而不可及的!

名师启蒙,探索糖链“森林”的天声人语

药明康德:在您的学习和成长过程中,有哪些师长对您选择糖科学的研究方向起到了重要的引导作用?科研之外,又有哪些兴趣爱好给您带来了不一样的收获?

叶新山教授:我从武汉大学硕士毕业之后在华中农业大学从事教学工作。五年之后,承蒙我在武汉大学时的老师牛长荣老师的推荐,我去香港中文大学化学系攻读博士学位。时值90年代初,那时即使面对托福考试的报名费用,对我来说都是一笔不小的费用,所以我欣然前往没有语言考试压力的香港求学。

▲中国科学院院士黄乃正教授

在香港我有幸师从黄乃正院士,受到了严格的有机化学训练,之后他推荐我进入美国Scripps研究所进行博士后研究。在美国我才开始接触糖化学,导师翁启惠教授是美国科学院院士,当时我加入了前沿性的寡糖库组装项目,成功组装了具有高度分支结构的寡糖库,并和其他成员一起合作发展了计算机辅助的程序化一釜寡糖合成策略,可以说是在导师的带领下实现了寡糖合成领域的重大突破。

在多年的科研生涯之外,我非常喜欢阅读历史书籍。英国哲学家培根曾留下过名言:“读史使人明智,读诗使人灵秀,数学使人周密,科学使人深刻。”凡有所学,皆成性格!中国作为文明古国,数千年灿烂的文化给我们带来丰富的汲养,而军事史中的谋略故事也常常给我们的生活和工作带来灵感。事实上科学实验有时恰似一场战役,“射人先射马、擒贼先擒王”、“扬汤止沸莫若釜底抽薪”这些集形象与抽象与一体的谋略,有时能够很直接地运用于反应路线的设计上。我甚至还设想将来有时间要撰写一部皖江革命史随笔,记录幼年时代起从长辈口中和书本上了解到的故乡革命历史故事;口述历史也是宝贵的文化资源,如果不能及时记录整理也许就此湮灭了。

▲叶新山教授

药明康德:对于糖科学未来的发展,您觉得有哪些亟待提高的领域以及具体的突破方向?

叶新山教授:之前我谈到了糖类化合物在分析测序方面仍然缺乏高效的手段,所以至今通过X光衍射和冷冻电镜等仪器观测到的蛋白质结构都直接脱去了“糖衣”。但不少创新分析方法仍不断问世,包括核磁共振技术、各种质谱技术、糖标记技术的发展。不过我仍然希望在不远的将来,会有高效的糖测序仪能够成功研制,这对于糖类化合物的分析和合成可能会带来划时代的质变。另外,我也期待着糖链合成技术的更大进步,能够有更为高效的寡糖合成仪面世。

另一方面,从基础研究的角度来看,蛋白质糖基化修饰中糖链的功能需要进一步理解。蛋白糖基化是重要的翻译后修饰形式之一,同一蛋白质分子可以在不同的位点发生不同的糖基化修饰,在同样位点的糖基化也可产生不同的糖链,这个复杂多变的过程究竟蕴含着怎样的精准信息?这是糖科学家努力研究的方向。从糖类药物的研究来看,糖类药物作为药物研究中新的前沿将迎来更多的发展机遇;其中糖疫苗作为一种新型疫苗,对传染病和肿瘤等重大疾病的防治有重要意义。目前各类糖疫苗研究刚刚起步,已经有少量糖疫苗上市,更多的糖疫苗和糖蛋白疫苗则处于临床研发阶段,充满着希望。

在人类基因组计划完成之后,多种组学应运而生。基于糖类化合物生物功能以及蛋白糖基化功能的分析研究,从上世纪末开始诞生了崭新的糖组学,其主要研究范围包括四类:糖蛋白与基因编码之间的关系,糖基化位点信息,聚糖结构信息,糖基化与蛋白质相互作用及功能信息。相信糖组学的研究可以给予糖科学家更多突破性的视野和思路,并为糖类化合物在疾病的预防、诊断和治疗方面的应用提供新的策略。